Consejo técnico: Diseñar métodos analíticos exitosos utilizando HILIC como mecanismo de retención alternativo

Descripción general:  este consejo técnico describirá la cromatografía de interacción hidrófila (o cromatografía líquida de interacción hidrófila, HILIC) como un mecanismo de retención alternativo que es particularmente eficaz para LC-MS. HILIC utiliza altos niveles de solvente orgánico para eluir los compuestos polares, lo que ayuda a mejorar su eficiencia de ionización durante LC-MS.

Los candidatos a fármacos modernos presentan muchos desafíos cromatográficos, ya sea la detección o la resolución de una impureza coeluyente. Una de las dificultades más comunes que se enfrentan es la retención y resolución de compuestos polares que no son susceptibles de condiciones típicas de fase inversa C18.

Muchas fases estacionarias tradicionales de HPLC de fase inversa no proporcionan una retención adecuada para muchos de los cada vez más numerosos compuestos polares analizados por HPLC. Estos compuestos a menudo no se retienen en el volumen vacío de la columna, se retienen tan mal que su forma de pico se ve comprometida, o se coeluyen con otros picos mal retenidos. Los picos de elución temprana también eluyen en una zona de supresión de iones que es problemática para las personas que utilizan instrumentos LC-MS.

Consejo:  HILIC funciona reteniendo compuestos polares en una capa rica en agua que se forma en la superficie de la partícula de sílice como resultado de una fase estacionaria polar (Fig.1)

HILIC actúa reteniendo compuestos polares en una capa rica en agua que se forma en la superficie de la partícula de sílice como resultado de una fase estacionaria polar.

El acetonitrilo (MeCN) es el solvente débil durante HILIC y el tampón de amonio el solvente fuerte. Las sales de amonio son críticas como contraión, ya que facilitan la formación de la bicapa crítica para la separación, como se muestra en la Figura 1.

Una fase estacionaria rica en polar atrae una capa rica en agua a su superficie, lo que promueve la retención de compuestos polares en la fase estacionaria. Los compuestos polares se eluyen a medida que aumenta la cantidad de agua en la parte móvil de la columna. Esto interrumpe la retención de analitos polares a lo largo de la fase estacionaria polar para inducir la elución.

Es importante que equilibre completamente su columna HILIC antes de usarla para asegurarse de que esta capa rica en agua haya tenido el tiempo adecuado para formarse. Si esto no ha ocurrido, no verá una retención constante de su compuesto o la solidez de su método.

Mencionamos el uso de tampones de amonio y hay varios otros factores dentro de un método HILIC que también son críticos para su éxito.

La primera es la selectividad, para la cual la columna correcta es clave. Al igual que con las columnas de fase inversa, existen muchas fases estacionarias diferentes para la cromatografía HILIC y cada una ofrece diferentes perfiles de selectividad y beneficios. Le recomendamos que siempre se esfuerce por examinar 3 fases de diferentes químicas para determinar cuál ofrece la mejor selectividad para su aplicación.

Los tipos de fases estacionarias HILIC que podría considerar incluyen:

  • sílice no derivatizada como  Kinetex HILIC
  • fases diol como  Luna HILIC
  • Fases de NH2
  • químicas iónicas / bipolares

Es importante en la fase móvil utilizar MeCN como componente orgánico. Los disolventes próticos como el metanol alterarán esta formación de bicapa discutida anteriormente. La cantidad de orgánico también es importante ya que si es un porcentaje demasiado alto en el punto de partida del gradiente inicial, complicará y prolongará el equilibrio de la bicapa. Las condiciones ideales del método inicial deben ser un 90% orgánico.

El perfil de gradiente debe ser 90% MeCN – 50% siempre que sea posible. Esto asegura que la bicapa esté completamente equilibrada al comienzo del gradiente. Si se requieren condiciones superiores al 50% de tampón para eluir el compuesto, es probable que el método no sea el más adecuado para HILIC, y una fase estacionaria de tipo polar C18 podría ser una mejor opción.

Deberá volver a equilibrar la bicapa después de cada ejecución de gradiente. Cuanto mayor sea el porcentaje de búfer al final del gradiente, más tiempo llevará este proceso de reequilibrio. El reequilibrio incompleto del búfer dará lugar a una mala reproducibilidad y una falta de robustez del método.

El último parámetro que debe considerar cuidadosamente es el pH. Deben examinarse al menos 2 pH diferentes y, por lo general, sugerimos un pH de 3,2 con formiato de amonio y 5,8 con acetato de amonio. Diferentes pH pueden conducir a selectividades significativamente diferentes (Fig. 2).

Punta HILIC: diferentes pH pueden conducir a selectividades significativamente diferentes

HILIC es una herramienta muy útil para promover la retención de compuestos polares. El método puede ser una forma desafiante de construir robustez, pero con cuidadosas elecciones de fase móvil y parámetros de método, puede conducir a separaciones exitosas para gravar compuestos.