Autor invitado – Helen Whitby, PhD

Un tampón es una solución ACUOSA que contiene un ácido débil y su base conjugada (o una base débil y su ácido conjugado). El pH de una solución tampón cambia muy poco cuando se le agrega una pequeña cantidad de ácido o base fuerte y puede ayudar a anular los cambios de condiciones en un método analítico cuando varían pequeños factores ambientales.

Las soluciones tampón se utilizan para mantener el pH a un valor casi constante. Son resistentes al cambio de pH debido a la presencia de un equilibrio entre este ácido débil (HA) y su base conjugada (B).

Cambio de pH debido a la presencia de un equilibrio entre este ácido débil (HA) y su base conjugada (B)

Cómo funciona un búfer

Cuando se agrega algo de ácido fuerte (más H + ) a una mezcla de equilibrio del ácido débil y su base conjugada, el equilibrio se desplaza hacia la izquierda, según el principio de Le Chatelier . De manera similar, si se agrega una base fuerte a la mezcla, la concentración de iones de hidrógeno disminuye menos de la cantidad esperada para la cantidad de base agregada.

Al preparar un búfer, hay algunas pautas generales que debe seguir:

  • Calibre el medidor de pH idealmente a valores de pH por encima y por debajo del objetivo para su preparación de tampón. Existen soluciones tampón calibradas que se venden para este propósito .
  • Pese la sal tampón para obtener la concentración de tampón deseada.
  • Agregue a un matraz aforado que contenga agua de grado HPLC y mezcle bien para disolver.
  • Con una sonda de pH y un medidor de pH, mida el pH de la solución.
  • Ajuste el pH al valor deseado mediante la adición de pequeños volúmenes de ácido fuerte y / o base fuerte.
  • Una vez que el pH sea correcto, diluya la solución hasta el volumen final deseado y mezcle bien.

Los tampones de HPLC se utilizan típicamente para controlar interacciones secundarias que generalmente se consideran no deseadas en el mundo cromatográfico. También se utilizan para controlar el estado de ionización del analito para garantizar que no esté presente en más de un estado ionizado.

El pKa de un compuesto presenta el pH al que está 50% ionizado y 50% neutro. Si trabaja con este pH, verá picos divididos y tiempos de retención variables. Todos los métodos deben esforzarse por trabajar al menos a dos unidades de pH del pKa de su analito objetivo.

Explicación de compuestos ácidos vs compuestos básicos para fase móvil
ácidos vs bases para la fase móvil explicado

Al preparar fases móviles isocráticas, hay algunas consideraciones más para garantizar una buena solidez del método.

  • Mezcle previamente su fase móvil siempre que sea posible, ya que esto eliminará los errores de la bomba.
  • Utilice siempre el mismo método de preparación. Por ejemplo, si agrega el agua primero, siempre debe agregarla primero. Si mide los componentes individuales y luego mezcla, debe hacerlo siempre de esta manera. No cambie este proceso ya que los resultados pueden variar significativamente en términos de tiempo de retención del analito.

A continuación se muestra un experimento que muestra esta variabilidad cuando las fases móviles se mezclaron de las siguientes formas.

  1. Agua primero: 400 ml de agua en un cilindro graduado, agregar a un matraz aforado de 1 litro, luego diluir para marcar con MeOH.
  2. MeOH Primero: 600 ml de MeOH en un cilindro graduado, agregar a un matraz aforado de 1 litro y luego diluir para marcar con agua.
  3. MeOH y agua medidos individualmente : 600 ml de MeOH en el cilindro graduado, transfiera el depósito de la fase móvil, 400 ml de agua en el mismo cilindro graduado y luego transfiera al depósito de la fase móvil.
  4. Deje que la bomba mezcle A = Agua con B = MeOH
búferes para la fase móvil

Las concentraciones de tampón también son importantes. En general, se considera que las concentraciones por debajo de 10 mM no ofrecen la capacidad de tamponamiento requerida para controlar la actividad del silanol o el estado de ionización de un compuesto y 10 mM se consideraría la concentración mínima efectiva para la fase reversa y HILIC. Para otras técnicas, como la exclusión por tamaño, se requieren concentraciones significativamente más altas y no es raro ver concentraciones superiores a 100 mM para estos métodos.

La concentración de tampón es algo que debe equilibrarse cuidadosamente para garantizar que se pueda lograr la solubilidad en todas las condiciones. Cuando trabaje en condiciones de fase inversa, es posible que deba limitar la concentración del tampón si está trabajando si el método contiene altos niveles de materia orgánica (a través de un gradiente, por ejemplo) para garantizar que no se produzca precipitación del tampón.

La fase móvil contribuye tanto a la selectividad como su fase estacionaria y el cuidado con la selección y preparación es tan importante como las fases estacionarias de prueba por lotes cuando se desarrollan métodos de HPLC robustos.